摘要
作者使用同步感染对HBV内化动力学进行定量，发现HBV在4℃时附着于细胞的过程与NTCP无关，但随后的内化取决于NTCP，且在感染12h后达到饱和。HBV的摄取依赖网格蛋白（clathrin）和动力蛋白（dynamin）。在感染的前6小时中，肌动蛋白（actin）和微管蛋白（tubulin）发挥了作用。感染6h后可在细胞核中检测到HBVDNA，感染24h后首次检测到cccDNA。研究表明，大多数（83％）结合的病毒颗粒进入HepG2-NTCP细胞，但只有少数（1％）的胞内rcDNA转化为cccDNA，提示体外建立感染的速率受限。这体现了体外细胞培养系统的不足，并将为设计和评估支持有效HBV复制的生理模型提供参考。
共价闭合环状DNA（cccDNA）在乙型肝炎病毒（HBV）的生命周期中发挥着关键作用，但人们对调节cccDNA生成和半衰期的宿主因素理解有限。HBV进入宿主细胞是感染生命周期的第一步，这一过程由病毒编码蛋白和决定内化途径的细胞受体之间的特异性相互作用来介导。HBV主要受体牛磺胆酸钠共转运多肽（NTCP）的发现推动了支持HBV完整复制周期的体外培养系统的发展，使研究病毒生命周期的早期步骤成为可能。
HBV编码3种包膜糖蛋白：小（S）、中（M）和大（L），HBV首先以低亲和力与肝素硫酸蛋白多糖（HSPG）结合；随后，L蛋白的preS1区以高亲和力与NTCP结合。模拟NTCP的preS1结合位点的合成肽，如Myrcludex-B（MyrB），可以抑制HBV感染。迄今为止，NTCP在HBV内化中所起的作用尚不明确。据报道，HBV的内吞途径依赖于网格蛋白和小凹蛋白（caveolin）。HBV与NTCP结合可以激活表皮生长因子受体，下游信号通路通过未知的途径促进病毒运输到内体。调节HBV摄取和胞内颗粒转运的宿主途径值得进一步研究。
目前的HBV培养系统使用高病毒接种量（每个细胞至10,xHBV基因组当量），并经常需要聚乙二醇（PEG）介导的沉淀来引发感染，这表明体外模型系统效率低下，可能无法代表肝脏环境。Asabe等报道，单个HBV颗粒足以感染黑猩猩，说明HBV颗粒在体内具有感染性。为了探索HBV感染表达NTCP的人类肝细胞衍生细胞所需的生命周期早期步骤，该研究建立了同步感染方案以量化HBV内化和早期胞内运输。在这一方案中，HBV内化和颗粒入核较为有效，细胞表面附着的80％以上的病毒进入细胞。然而，新导入的部分双链松弛环状DNA（rcDNA）转化为cccDNA的效率低下，揭示了其可能为当前建立的体外生产性感染模型系统的限速步骤。
01
量化HBV附着与内化
为了量化HBV的附着和内化动力学，作者使用了一种成熟的方法，使病毒在冰上与细胞结合，继而将培养物转移至37°C以促进病毒的吸收，并用胰蛋白酶将未内化的病毒去除（图1）。
图1HBV同步感染方案示意图
该方法可将HBV颗粒同步摄取到靶细胞中，通过对HBVrcDNA基因组的PCR定量可以将HBV颗粒量化。将含大量HBV病毒颗粒的HepAD38细胞培养上清液在肝素亲和柱上纯化，然后进行蔗糖梯度离心。浓缩液包含了成熟的B基因型感染性HBV颗粒和含L蛋白的管状亚病毒颗粒。聚乙二醇8（PEG）通常用于人原代肝细胞、HepaRG细胞和HepG2-NTCP细胞等细胞培养系统中，以增强HBV感染。由于这种药物会沉淀病毒，并且据报道可促进质膜上的1型单纯疱疹病毒融合等，因此该研究的所有实验均未使用PEG。该团队先前曾工程化改造HepG2细胞，使其表达NTCP并支持HBV复制。他们选择K7亚克隆进行动力学实验，证实NTCP表达（图2a）。初步实验优化了胰蛋白酶消化方案，确保清除未内化的病毒（图2b）。HBV与HepG2和HepG2-NTCP细胞均相当地、以剂量依赖性的方式发生结合（图2b-c），这表明在低温下病毒附着与NTCP无关。
图2对附着到靶细胞的HBV进行定量
为了评估NTCP在HBV内化中的作用，作者在4°C下用感染复数（MOI）为每个细胞倍基因组当量的病毒分别接种于HepG2和HepG2-NTCP细胞，在4°C下孵育1h后，转移到37°C孵育1h、3h或6h，再用胰蛋白酶消化以去除未内化的病毒颗粒。然后，计量与细胞相关的HBVDNA。在37°C下培养下，与细胞相关的胰蛋白酶抗性的HBVDNA随培养时间增加，6h后HepG2-NTCP细胞的病毒DNA水平显著高于HepG2细胞（图3a）。作者用人肝癌细胞Huh-7也证实了这些观察。大部分关于HBV复制的体外研究利用二甲基亚砜（DMSO）阻止靶细胞的增殖，作者也评估了DMSO对HBV内化的影响。在未经或经过2.5%DMSO处理3天的HepG2-NTCP细胞中，内化的HBVDNA水平相当，表明DMSO在调节病毒摄取的早期步骤中作用很小。
为了评估对病毒内化检测的特异性，作者评估了已知的HBV进入抑制剂的作用。肝素可以与病毒竞争结合细胞HSPGs；MyrB和Hepatect是中和病毒感染的多克隆抗HBVIg。所有进入抑制剂的使用浓度均能中和90％以上的HBV感染（根据感染后5d的HBeAg表达判断），并在接种后6h将细胞内HBVDNA水平显着降低80％以上（图3b）。这些数据证实，HBV内化取决于细胞HSPG、NTCP和病毒表面糖蛋白。
由于注意到HBV内化到HepG2细胞中的水平很低，因此作者想探究HBV是否可以建立有效的感染。将细胞在37°C下培养3天并监测cccDNA水平，仅在HepG2-NTCP细胞中检测到cccDNA，表明缺乏NTCP的亲本HepG2细胞所摄取的病毒不具备生产性（图3c）。为了确定早期HBV内化步骤是否限制了生产性感染的建立，作者在同步感染1h、3h或6h后培养HepG2-NTCP细胞3天和7天，并检测HBeAg表达水平以衡量cccDNA转录活性。HBV颗粒对胰蛋白酶敏感，并且感染力降至约1/10。培养3天和7天后，HBeAg水平与接种持续的时间存在显著关联（图3d），表明内化病毒的数量决定了病毒复制。
为了扩展和验证这些观察结果，作者通过检测HBV颗粒相关的核心或表面包膜糖蛋白，评估了HepG2-NTCP细胞的HBV内化动力学（图3e）。Westernblot结果表明，在内化8h时出现胞内核心和与表面糖蛋白相关颗粒的峰值，随后下降。细胞内HBVDNA在内化12h后延迟出峰。考虑到蛋白质印迹的半定量性质，这些数据与较早的PCR数据高度吻合，并体现了HBV颗粒的时间依赖性内化，在接种后8-12h达到饱和。
图3HBV内化动力学
02
dHepaRG细胞的HBV进入动力学
双能的HepaRG细胞系可以分化为胆管样上皮细胞和表达内源性NTCP并支持HBV复制的肝细胞样细胞，肝细胞:胆管细胞的比例通常为1：1。使用MyrB对分化的细胞进行NTCP表达染色，结果显示与HepG2-NTCP细胞相比，表达NTCP的细胞的频率更低。在无PEG的条件下尝试研究dHepaRG细胞对HBV的摄取，未检测到胞内病毒DNA。作者的既往研究在接种物中加入PEG8，可使HBV摄取增加到10倍。添加PEG，用HBV接种dHepaRG细胞6小时后，其病毒摄取动力学与过表达NTCP的HepG2和Huh-7细胞的相当。这些数据表明，NTCP的表达水平本身对HBV内化动力学的影响可忽略不计，但可能调节内化病毒的绝对水平。作者研究HBV内化进入PHHs的结果不佳，即使在有PEG的条件下，病毒摄取也有限，显示出较高的供体多样性。
03
调节HBV内化的细胞通路
为了研究调节HBV内化的细胞通路，作者评估了一组针对细胞运输各种通路的药物：3-羟基-2-萘甲酸[(3,4-二羟基苯基)亚甲基]酰肼（Dynasore）抑制发动蛋白并阻止质膜形成囊泡；Pitstop2抑制网格蛋白介导的内吞作用；乙基异丙基阿米洛利（EIPA）靶向Na?/H?交换泵，从而抑制巨胞饮（macropinocytosis）作用。作者通过抑制FITC标记的转铁蛋白摄取和水泡性口炎病毒（VSV）的假病毒颗粒感染，证实了Pitstop和Dynasore在靶向HepG2-NTCP细胞中的网格蛋白和动力蛋白依赖性内吞作用方面具有特异性。接种6h后，作者评估了所有药物抑制HBV内化进入HepG2-NTCP或Huh-7NTCP细胞的能力，并在5天后检测HBeAg表达。肝素和MyrB被作为已知的抑制HBV摄取的阳性对照。在病毒接种阶段用Dynasore和Pitstop预处理细胞并维持，抑制了两种细胞系对HBV的摄取（图4a-b），表明吞噬过程依赖于发动蛋白和网格蛋白。相比之下，EIPA对HBV内化没有影响，表明微胞饮（micropinocytosis）在肝细胞摄取病毒的过程中发挥的作用可以忽略。这些观察结果在接种后第5天通过检测HBeAg表达得到了证实（图4a-b）。为了研究宿主细胞骨架在调节HBV摄取中的作用，分别用诺考达唑（Nocodazole）或细胞松弛素D（cytochalasinD）处理HepG2-NTCP细胞，两者分别干扰微管和肌动蛋白的动力学（图4c）。这两种药物显著抑制了感染后6h内HBV的摄取和HBeAg水平，这表明微管和肌动蛋白丝在调节细胞内衣壳运输中发挥了作用。
图4HBV利用细胞运输通路
04
乙肝病毒从细胞质向细胞核迁移的动力学
为了研究cccDNA产生前HBV生命周期的早期步骤，作者分析了亚细胞组分中的胞内HBVDNA。先进行HBV同步感染，在胰蛋白酶消化后的早期（1、3、6、8和12h）和晚期（24、48和72h）收集胞质和胞核组分，定量检测HBVDNA和cccDNA。通过分别检测胞质中的α-微管蛋白和胞核中的核纤层蛋白A/C，以及DNA样品中管家基因PRNP的存在，来确认细胞分离（参见图4）。在37°C孵育细胞，1小时内首先在胞质中检测到HBVDNA，并在3小时后检测到向核运输的颗粒（图5a）。到12h时，胞质和胞核中的HBVDNA水平达到饱和，且胞质中病毒DNA的水平是胞核中的3.5倍，24h后胞核和胞质组分中的病毒DNA减少（图5a）。作者通过PCR定量检测胞质和胞核组分中的cccDNA，感染后24h首先在胞核中检测到cccDNA，随后不断增加（图5b）。
图5HBV入核动力学
05
确定HBV感染的限速步骤
优化同步感染方案后，作者对HepG2和HepG2-NTCP细胞中的HBV附着（4°C，1h）、内化（6h，推测的半最大值）和cccDNA（72h）水平进行了定量。在4°C下，与HepG2-NTCP和HepG2粘附的病毒水平相近（分别为25％和17％），与HSPG在决定病毒与细胞表面的初始结合中的作用一致（表1）。细胞结合颗粒中的大多数（84％）进入了HepG2-NTCP细胞。作者在HepG2细胞中观察到高水平（46％）的细胞内HBVDNA，但未能在这些细胞中检测到任何cccDNA，这很可能反映了这些细胞非生产性的摄取途径（表1）。最终，在内化6h被检测到的细胞内HBVDNA中，只有不到1％在72小时内被转化为cccDNA。作者定量rc-和cccDNA的检测限是每个反应个拷贝，表明较早的结论不受PCR方法灵敏度差异的偏倚。总之，这些数据表明颗粒内化是有效的，大多数细胞结合颗粒进入表达NTCP的细胞，至少22％的病毒颗粒相关DNA在12h内到达细胞核。然而，后续的将传入的rcDNA转换为cccDNA的效率较低，为建立生产性感染的限速步骤。
表1HBV生命周期早期限速步骤
讨论
尽管确定了HBV对特定物种和组织的嗜性，但目前对HBV感染早期阶段了解甚少。为了解决这一空白，该文作者开发了一种用于量化颗粒的内化和核转运的测定方法，以识别早期病毒生命周期中的限速步骤。乙肝病毒与冰上冷却的HepG2和HepG2-NTCP的结合相当，表明大部分附着独立于NTCP而发生，这与HSPG在介导HBV对目标细胞的低亲和力附着中的作用一致。
NTCP在调节HepG2和Huh-7细胞对HBV的摄取以及建立有效的感染过程中具有重要作用。通过测量胞内HBVDNA或病毒相关核心和包膜蛋白，作者注意到了颗粒吸收的时间依赖性。病毒DNA和蛋白达到最高水平的时间可能反映了基因组和蛋白质的不同半衰期。1小时后首先在细胞质中检测到HBVDNA，3小时后在细胞核中检测到HBVDNA。HBV核心蛋白编码一个以α/β介导的方式将衣壳靶向核孔复合体（NPC）的核定位序列，但并不确定HBV衣壳到达NPC的时间。据报道，鸭原代肝细胞（PDH）的鸭乙型肝炎病毒（DHBV）进入动力学相似，4小时后细胞核出现DHBVDNA；这些数据与报道的其他包膜病毒（包括HIV）的胞内运输时间的报告一致。
成像技术的最新进展使病毒颗粒的内化可视化。有研究报道使用荧光标记的HBV病毒结构蛋白或亚病毒颗粒。但是，这些方法带有一定的局限性，因为标签会损害病毒的感染性，并不总是与自然感染相似。作者尝试对内化HBV的大（L）包膜蛋白进行成像，在感染的前3小时信号非常微弱。可视化HBV包膜和基因组的组合方法或许可以帮助人们更好地理解病毒融合、脱膜与核转运。Herrscher等近期使用电子显微镜（EM）和带有免疫金标记的cryo-EM，发现网格蛋白包被的小泡（pits）和囊泡（vesicles）中存在HBV，与依赖网格蛋白的胞吞途径一致。
作者在24小时后首次在同步感染分析中检测到cccDNA，与DHBV感染的报道一致。考虑到PCR使用T5核酸外切酶可能导致的cccDNA损失，根据已有数据可以推测细胞内衣壳化rcDNA仅有少数（1％）被转化为cccDNA。在感染的第6-12小时，细胞核中的HBVDNA多达细胞内HBVDNA的22％，这表明基因组脱壳和跨核膜运输并非cccDNA生成的限速步骤。rcDNA转化为cccDNA的机制尚未完全阐明，目前已经报道了许多宿主途径，都可能在人类肝癌细胞中限制了转化的效率。（本
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