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全球约2.4亿人感染了HBV和HCV。其感染的慢性化是治疗中最棘手问题和肝癌发生的重要原因，但具体机制还有待完善。外泌体的发现和研究，为HBV/HCV感染和慢性化提供了新的视角。外泌体是由多种细胞在正常及病理情况下分泌的一类直径约为30～nm的小囊泡，具有脂质双层膜结构。年以来，研究发现外泌体中含有细胞特异的蛋白、脂质和核酸，特别是微小RNA(microRNA，miRNA)，可作为信号分子随外泌体传递给其他细胞从而改变它们的功能。有报道肝炎病毒的所有成分都可被外泌体传递。Yang等鉴定发现，HBV感染者外周血血清分离的外泌体中含有大量HBV成分，包括HBVDNA和RNA，其中HBsAg和HBeAg分别可达1.9～5.4ng，5.2～1.5nCU。这些成分可随外泌体传染给自然杀伤(naturalkiller，NK)细胞，从而抑制NK细胞功能，引起γ－干扰素(interferon－γ，IFN－γ)表达下降。Kouwaki等研究证明，外泌体中的HBVDNA/RNA可以刺激人巨噬细胞THP－1中ΜLBP2的表达增强，最终影响IL－12的分泌。
因此，外泌体可能已经成为HBV的一种重要传播介质。本文将以HBV和HCV感染者血清外泌体中的标志物存在情况及其对检验结果的影响进行分析，探讨检测血清外泌体肝炎标志物的意义。
外泌体的生成和分泌
20世纪70年代，Crawford就发现，除了可溶性的分子，细胞外囊泡是细胞之间通讯的重要手段之一。基于细胞外囊泡的不同来源，Kooijmans将之分为几种类型：细胞凋亡后产生的50nm至5μm的凋亡小体；细胞膜向外出芽裂变形成的50～nm的微囊泡；细胞膜向内出芽裂变形成的40～nm外泌体。细胞外囊泡都可以以包裹的方式将细胞内容物纳入囊泡中。
细胞内吞过程中形成的早期内涵体，经内部酸化再成熟为晚期内涵体，之后通过内向出芽方式，包裹选择性负载的蛋白、核酸等物质形成外泌体的前体——管腔囊泡(intraluminalvesicles，ILVs)。晚期内涵体内包含多个ILVs后，即成为多胞体(multivesicularbody，MVB)，大部分MVB被运送至溶酶体后导致MVB的内含物降解，而小部分MVB的膜表面有CD63、溶酶体跨膜蛋白1(lysosomalmembraneprotein，LAMP1)、LAMP2等，可介导其与细胞质膜融合，在细胞内Rab蛋白牵引下，MVB与细胞表面融合并向胞外释放外泌体。
作为细胞间通讯的重要手段，外泌体中包涵的核酸和蛋白质可以通过外泌体与靶细胞的结合，被传递而发挥作用。研究表明，释放到细胞外的外泌体，既可分布于分泌细胞的周边，也可通过多种途径进入血液、尿液、唾液、脑脊液等多种体液中。其与靶细胞的相互作用主要有两种方式：(1)特异性作用：通过特异性抗原抗体作用相互识别；(2)非特异性作用：靶细胞通过细胞内吞作用将外泌体吞入胞内。
这提示外泌体是细胞内容物释放或分泌的新机制。有些分子是以可溶性方式通过转运高尔基体网分泌到细胞外的；而所有分子，包括分泌和非分泌性核酸和蛋白质，都可通过外泌体释放到细胞外。
细胞外HBV和HCV标志物的来源
在肝炎病毒复制、包装和释放的过程中，目前理论仍然停留在内质网－高尔基体时代。长期以来，人们认为，HBsAg和HBeAg也是通过内质网－转运高尔基体网被释放出细胞外的。但多项研究表明，HBsAg和HBeAg并不能与内质网和高尔基体共定位，超微电镜也发现这些抗原所在的膜室结构标志物并不同于内质网或高尔基体。更有意义的是，Abdulkarim等最新发现HBsAg主要聚集于核周隙部位，在动力蛋白2存在的情况下才能分泌出细胞外；如果动力蛋白2突变，细胞外HBsAg则大量减少。同时，如果用UA抑制了MVB的合成，也会看到HCV的细胞外释放减少，却在胞内集聚50倍以上。这些都提示，HbsAg、HbeAg，甚至病毒DNA和RNA的分泌途径经过了外泌体。
目前，尚无证据表明动力蛋白2是外泌体相关的标志物，或者是外泌体的分子马达。但却有证据表明HBsAg和HBeAg大量存在于外泌体中。有学者发现，HBV感染者外周血血清中分离出外泌体中包裹有大量的病毒成分，包括DNA、RNA、HBsAg和HBeAg。还有研究报道，HCV患者肝细胞中分离出的外泌体中存在完整的病毒RNA、蛋白和病毒颗粒。外泌体可能是病毒转移感染下一个细胞的重要途径。
外泌体是肝炎病毒的重要传播介质
人们首先发现，外泌体可以介导HCV的感染。Ramakrishnaiah等研究表明，HCV感染者的外泌体可体外引起肝细胞系Huh7.5.1细胞发生HCV感染，即检出HCVRNA；而且，外泌体可以保护其中的HCV免受IgG中和作用，发生免疫逃逸。又有学者发现，外泌体中HCVRNA与Ago2－miR－HSP90形成了复合体，增强了HCVRNA的稳定性，提高了复制能力。而且，外泌体还能将HCV传递给树突细胞(dendriticcell，DC)，刺激Ⅰ型IFN的产生。继而Yang等观察到，携带有HBVDNA和蛋白质的外泌体，经荧光色素DiD标记并感染NK细胞后，可在NK细胞中检出相应的外泌体并检出HBVDNA，包括松弛环状的双链DNA(relaxedcircularDNA，rcDNA)和共价闭合环状DNA(covalentlyclosedcircularDNA，cccDNA)；通过透射电镜可见NK细胞中的病毒颗粒；进入NK细胞的HBV可经视黄酸(维甲酸)诱导基因蛋白I(retinoicacid－induciblegeneI，RIG－1)依赖的方式抑制核因子κB(nuclearfactorκB，NF－κB)和p38的活性而影响NK细胞的功能。而且，应该注意到，病毒RNA可通过RIG－1样受体(RIG－I－likereceptors，RLRs)途径激活天然免疫系统。这给外泌体介导的病毒感染的作用赋予了更加重要的意义。
单核细胞感染是HBV疫苗逃逸的重要策略之一，也是肝移植后HBV感染复发的重要原因，同时也是耐药作用产生的重要机制。目前对于该感染过程的唯一解释是pre－S1受体也存在于单核细胞膜表面。但这一结论并不十分可靠，因为Pontisso的研究只是发现抗pre－S1抗体可抑制病毒颗粒黏附在单核细胞上，抗pre－S2和抗HbsAb则不能，并没有真正观察到黏附过程。而外泌体介导的感染过程与之不同，可能根本不需要这些受体。这极大地丰富了HBV感染单核细胞的分子机制，同时也为疫苗逃逸给出了新的解释。但其中的转染机制尚有待进一步研究。
外泌体对于内容物的保护作用是显而易见的。虽然尚无证据表明抗病毒药物无法杀灭外泌体中的病毒，但是至少可见IgG无法中和其中的病毒成分。另外，外泌体中携带的一系列miRNA可发挥抑制免疫反应、促进慢性感染的作用。面对来自外泌体对治疗挑战，Li等用IFN－α处理肝非实质细胞(livernonparenchymalcells，LNPCs)后，分离其外泌体，然后作用于HBV感染的肝细胞，即将LNPCs中的抗病毒活性通过外泌体转移肝细胞，从而实现HBV感染细胞抗病毒功能的逆转，这是一次非常有意义的探索。
血清外泌体中肝炎标志物对检测的影响
在罗氏最新的CobasMPX方法检测HBV、HCV的研究中，研究者发现了17名健康人HbsAg阴性，而MPX检测HBVDNA阳性的情况。这样的隐匿性感染情况曾经多被解释为HbsAg突变，或检测敏感性低。但外泌体为这一矛盾提供了新的解释。因为核酸检测方法有裂解细胞膜和其他膜结构的环节，理论上也会破坏外泌体膜，从而可检测到外泌体中的DNA或RNA；而ELISA方法检测血清中的可溶性标志物如HbsAg和HbeAg则不含有类似的操作，因此存在外泌体中的HbsAg和HbeAg无法被检测到的可能。尤其令人担忧的是，如果外泌体是HbsAg和HbeAg的主要发源地，那么其对检测结果的临床意义的影响将大大增加。
在本实验室进行的初步调查中，我们分别检测了血清和血清分离的外泌体中的HBVDNA。在血清HBVDNA在范围内，两个检测结果相当，比值在0.15～1.6之间；在血清HBVDNA在以上的8份标本中，外泌体HBVDNA含量则明显高于血清值，最高可达9.8倍。这一结果一方面提示，外泌体是HBVDNA的重要来源；另一方面，核酸检测对于临床治疗效果的判断不会由于其存在于外泌体而产生明显差异。但是，在对两种样本HbsAg的检测中可见，血清外泌体中含有大量的HBsAg，其相对含量高于血清：HbeAg在43份标本中19份外泌体高于血清，24份血清高于外泌体，最高差距倍。外泌体中的HbsAg和HbeAg对感染情况的判读产生了重要影响。
鉴于此，我们至少相信，DNA和RNA的检测结果的金标准的意义将由于不受外泌体的影响而进一步增强；隐匿性感染的又一个原因是病毒标志物存在于外泌体。对此，需展开更深入的研究，分析外泌体在HBV和HCV的核酸和抗原释放机制，探讨外泌体的存在对这些标志物检测结果和临床意义的切实影响。
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